近日，南昌大學(xué)黃志兵教授課題組在《Food Research International》上發(fā)表了題目為“Comparative transcriptome analysis of Monascus purpureus at different fermentation times revealed candidate genes involved in exopolysaccharide biosynthesis”的研究性論文。
摘要：胞外多糖(EPS)是藥用食用菌紅曲霉的代謝產(chǎn)物，具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)和抗炎作用。但其生物合成機(jī)理尚不清楚，阻礙了其開(kāi)發(fā)利用。本研究對(duì)紫色紅曲的發(fā)酵條件進(jìn)行了優(yōu)化，并通過(guò)比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析了EPS合成的機(jī)制和影響。最佳培養(yǎng)基組成為40g/L甘露糖，4g/L酵母粉，1 g/L MgSO4?7H2O, 0.8 g/L KH2PO4，1.6 g/L K2HPO4?3H2O, 2ml/L吐溫80，最佳培養(yǎng)條件為接種量7%，培養(yǎng)溫度30℃，初始pH 6.0, 180 rpm，培養(yǎng)4d。共獲得8095個(gè)unigenes，鑒定出17種EPS合成的關(guān)鍵酶。有趣的是，與發(fā)酵2天相比，發(fā)酵4天組有12個(gè)碳水化合物代謝亞類富集，大部分差異表達(dá)基因(DEGs)上調(diào)，但只有9個(gè)差異表達(dá)基因(DEGs)隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)而富集，所有差異表達(dá)基因(DEGs)均下調(diào)。本研究為提高EPS含量提供了理論基礎(chǔ)，揭示了EPS合成動(dòng)態(tài)，為未來(lái)EPS分子修飾和基因敲除研究提供了重要靶點(diǎn)。
研究?jī)?nèi)容
1、培養(yǎng)基對(duì)EPS產(chǎn)生的影響
圖1：紫色紅曲發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化。不同碳源對(duì)(A)EPS和菌絲多糖產(chǎn)量及(B)菌絲生物量濃度的影響。(C)糖濃度對(duì)EPS產(chǎn)量和菌絲生物量濃度的影響。不同氮源對(duì)(D)EPS和菌絲多糖產(chǎn)量及(E)菌絲生物量濃度的影響。酵母提取物濃度(F)、MgSO4?7H2O濃度(G)、KH2PO4和K2HPO4?3H2O濃度(H)和表面活性劑類型(I)對(duì)EPS產(chǎn)量和菌絲生物量濃度的影響。
2、培養(yǎng)條件對(duì)EPS產(chǎn)量的影響
表1: 不同培養(yǎng)條件對(duì)紅曲霉胞外多糖(EPS)及生物量的影響
3、形態(tài)分析
圖2：(A)在100×、2500×、10000 ×放大率下，從左到右排列的紫色紅曲掃描電鏡圖像。(B)不同發(fā)酵條件下菌絲體宏觀形態(tài)。
4、紫色紅曲40269不同發(fā)酵時(shí)間的RNA-seq測(cè)序
圖3：用RNA-Seq分析不同發(fā)酵時(shí)間紫色紅曲的基因表達(dá)譜。(A)樣本表達(dá)式分布圖。(B)紫色紅曲在EMP2、EMP4和EMP6階段的主成分分析(PCA)。(C)紫色紅曲三個(gè)生物重復(fù)序列轉(zhuǎn)錄組間相關(guān)性的Spearman相關(guān)系數(shù)(SCC)分析。
5、unigenes的功能注釋
圖4：紫色紅曲的所有unigenes的生物信息學(xué)分析。(A) 紫色紅曲的GO功能分類。(B)碳水化合物代謝途徑分類。(C) KEGG通路單基因分配。
6、KEGG途徑分析參與EPS生物合成的功能基因
圖5：紫色紅曲EPS的生物合成途徑?；罨膯翁菃挝伙@示為紅色。編碼該酶的每個(gè)單基因在每一步的表達(dá)水平被顯示為熱圖。列EMP2、EMP4、EMP6分別對(duì)應(yīng)發(fā)酵時(shí)間的第2天、第4天、第6天。藍(lán)色和紅色分別代表低和高表達(dá)水平。非虛線箭頭表示酶促反應(yīng)，虛線箭頭表示經(jīng)過(guò)幾個(gè)步驟的幾個(gè)酶促反應(yīng)。
7、發(fā)酵過(guò)程中紫色紅曲40269的轉(zhuǎn)錄譜變化
圖6：紫色紅曲發(fā)酵過(guò)程中DEGs的數(shù)量。(A)在EMP2、EMP4和EMP6處的共同和唯一的DEGs在加粗維恩圖中表示。(B)不同組的DEGs數(shù)量。
圖7：DEGs的GO和KEGG富集分析。比較組中EMP2 vs EMP4 (A)、EMP4 vs EMP6 (B)、EMP2 vs EMP6 (C)前20個(gè)GO術(shù)語(yǔ)的分類和主要富集的顯著性圖。比較組中EMP2 vs EMP4 (D)、EMP4 vs EMP6 (E)、EMP2 vs EMP6 (F)前20個(gè)通路的顯著性氣泡圖。
8、關(guān)鍵酶的驗(yàn)證和分析
圖8：(A) RNA-seq結(jié)果中影響EPS合成的關(guān)鍵酶(HK、MPI、UGDH、GALE、pgm、GPI和cat)的表達(dá)。(B)影響紫色紅曲不同發(fā)酵時(shí)期EPS合成的關(guān)鍵酶(HK、MPI、UGDH、GALE、pgm、GPI和cat)的活性。
結(jié)論：
最佳培養(yǎng)基組成為:40 g/L甘露糖，4 g/L酵母粉，1 g/L MgSO4?7H2O, 0.8 g/L KH2PO4, 1.6 g/L K2HPO4?3H2O, 2ml /L吐溫80，最佳培養(yǎng)條件(接種量為7%，培養(yǎng)溫度30℃，初始pH6.0, 180 r/min，培養(yǎng)4 d)。
鑒定出參與EPS生物合成的17種關(guān)鍵酶(HK、PMM、MPI、GMPP、GPI、UGP2、pgm、AXS、abfA、GALE、E2.7.1.46、UGDH、UXE、USP、RHM、wbpP、aknA)，并對(duì)其進(jìn)行DEGs分析。
酶聯(lián)免疫分析驗(yàn)證了幾種關(guān)鍵酶，結(jié)果與RNA-seq分析結(jié)果一致。本研究闡明了EPS生物合成的可能機(jī)制，并對(duì)其合成途徑進(jìn)行了表征，為未來(lái)EPS分子修飾和基因敲除研究提供了重要靶點(diǎn)。然而，未來(lái)的研究應(yīng)該集中在調(diào)控EPS合成的關(guān)鍵候選基因的功能。
